اثر PH بر فعالیت انزیمی

به نام خدا

هدف از ازمایش

"بررسی عوامل فیزیکوشیمیایی بر فعالیت انزیم"

اثر PH بر فعالیت انزیمی

وسایل ازمایش

لوله ازمایش . محلول یدو لوگول . .محلول نیترات جیوه . محلول امیلاز . نشاسته..بن ماری

نام استاد مربوط

اقای دکتر مهتابی پور

نام استاد یار مربوط

خانم نقوی

نام اعضای نویسنده

حامد اقازاده

تاریخ

دوازدهم اردیبهشت 1392

مقدمه

آنزیم ها

به عنوان کاتالیزور های حیاتی و شیمیایی هستند ، واکنش های متابولیکی را تسهیل می کنند .

اهمیت آنزیم ها :

· چون واکنش های شیمیایی را تسهیل و تسریع می کنند پس حیات امکان پذیر است .

· بسیاری از ناهنجاری های ژنتیکی و مادرزادی ناشی از کمبود یک یا چند آنزیم است که به تشخیص کمک می کند .

· برخی از دارو ها با مهار یا تحریک عمل آنزیم ، عمل خود را ظاهر می کنند .

· برای بررسی عملکرد طبیعی یک ارگان، اندازه گیری ضروری است .

آنزیم ها به دو دسته تقسیم می شوند :

· یکسری فعالیت شان فقط به ساختمان پروتئینی بستگی دارد که اینها آنزیم های ساده هستند .

· آنزیم های مرکب : که علاوه بر ساختمان پروتئینی یکسری ترکیبات غیر پروتئینی هم دارند .

این ترکیب غیر پروتئینی می تواند فلز یا ماده ی غیر آلی باشد که اینها کوفاکتور و ممکن است ماده ی آلی باشد که به آنها کوآنزیم می گویند.

کوفاکتور ها شامل : Mg2⁺ ، Fe²⁺ ، Zn²⁺ ، Cu²⁺ و حتی Ca²⁺ باشد .

عملکرد این کوفاکتور به دو صورت است ، یا واسط هست برای اتصال آنزیم به ماده ی اولیه یا خودش عملکرد آنزیمی نشان می دهد (Fe²⁺ در ساختمان کاتالاز ، پراکسیداز و Cu²⁺ سیتوکروم اکسیداز و . . . وجود دارد . )

جایگاه فعال ( Catalytic site ) :

در واکنش های آنزیمی ماده ای که آنزیم روی آن اثر می کند به نام سوبسترا گفته می شود ، تمام آنزیم در واکنش شرکت نمی کند بلکه قسمت کوچکی از آنزیم که به نام جایگاه فعال است در واکنش شرکت کرده و حاوی اسید های آمینه ی سرین و هستیدین است ، ( هر آنزیم نیمه عمر خاصی دارد که بستگی به نوع آنزیم و فعالیت و محل تولید آن دارد)

ویژگی های آنزیم :

· ویژگی نوری : به استثنای آنزیم اپی مراز epimerase ، بقیه آنزیم ها روی سوبسترایی اثر می کنند که از لحاظ نوری یکسان باشد یا چپ بر ( - ) و یا راست بر ( + )

· ویژگی به نوع واکنش : هر آنزیمی در بدن واکنش مشخص را انجام می دهد مثلا ً ترنسفراز انتقال مواد را بر عهده دارد

· ویژگی برای نوع پیوند : بر اساس نوع پیوندی که آنزیم اثر می کند ، آنزیم ها مختلف هستند ، مثلا ً برخی آنزیم ها هیدرولیز می کنند و برخی ها ترکیب می کنند .

· ویژگی شیمیایی : هر آنزیم بر اساس ماهیت خودش عملکرد بیولوژیکی خاصی نشان می دهد مثلا ً تریپسین ، بعد از اسید های آمینه ی لیزین و آرژنین را می شکند .

اصول کلی :

· در واکنش های آنزیمی 3 ماده وجود دارد : سوبسترا ، آنزیم ، محصول

· در واکنش های آنزیمی ، آنزیم مصرف نشده سالم باقی می ماند

· برای واکنش های آنزیمی مقدار اندکی از آنزیم ضروری است

· در واکنش های آنزیمی ، آنزیم زمان رسیدن به تعادل را کوتاه می کند

· برای افزایش سرعت واکنش های شیمیایی آ نزیم ها انرژی مورد نیاز را کمتر می کنند

v اگر در یک واکنش غلظت سوبسترا و یا حرارت افزایش پیدا کند ، به دلیل افزایش تعداد برخورد های مؤثر سرعت بیشتر می شود ، برای اینکه ماده ی A به B تبدیل شود ، ابتدا بایستی انرژی بگیرد که به نام انرژی فعال سازی گفته می شود و بعد به ماده ی B تبدیل شود . آنزیم ها انرژی را کمتر می کنند

فاکتور های مؤثر بر واکنش های آنزیمی :

1 . حرارت : باعث افزایش سرعت واکنش می شود که این امر ناشی از افزایش تعداد برخورد های مؤثر است تا 50 درجه سانتی گراد مؤثر بوده و بعد از آن بدلیل تخریب و یا دناتوره شدن ساختمان عملکرد آنزیم از بین می رود شخصی به نام وانت هوف Vantt Hoff ضریب حرارتی را برای آنزیم ها ارزیابی کرده است که به ازای افزایش 10 درجه ی سانتی گراد سرعت واکنش مشخص خواهد شد ، این ضریب از 1/1 تا 3/5

تغیر است که در اکثر موارد 2 است

درجه ی حرارت اپتیمم Optimum : حرارتی که در آن دما بیشترین فعالیت را از خودش نشان می دهد

2 . PH : تغییرات PH هم بر روی آنزیم ها اثر می کند ، PH ای که بیشترین فعالیت را از خود نشان می دهد PH اپتیمم گویند که بین 5 تا 9 است

تغییرات PH باعث تغییر در قسمت های زیر می شود :

· در ساختمان خود آنزیم می تواند مؤثر باشد

· سویسترا را یونیزه می کند .

· اسید های آمینه ای را که در جایگاه فعال آنزیم هستند را یونیزه می کند .

3 . غلظت سوبسترا و غلظت آنزیم :

افزایش غلظت آنزیم و غلظت سوبسترا می تواند سرعت واکنش را زیاد کند این افزایش در دو مرحله انجام می شود :

· در غلظت کم سوبسترا ، تغییرات سرعت متناسب با تغیرات سوبسترا است و معادله به صورت خطی است

· با افزایش غلظت سوبسترا ، مرحله ای می رسد که در آن معادله افزایشی را از خود نشان نداده و افزایش غلظت سوبسترا ، سرعت را تغییر نمی دهد که به این سرعت ، سرعت ماکزیمم می گویند V_max . یعنی تمامی آنزیم ها از سوبسترا اشباع هستند و منحنی هم ثابت است .

غلظتی از سوبسترا که در آن غلظت سرعت واکنش نصف سرعت ماکزیمم بشود به آن ضریب میکائیلیس منتون ( Michaelis Menton ) می گویند

این دانشمند فرمول زیر را برای بررسی بهتر واکنش هاب آنزیمی در زمانی که غلضت سوبسترا یا سرعت واکنش تغییر پیدا می کند ، بیان کرده است .

سوبسترا S =

ضریب میکائلیس منتون K_m =

سرعت واکنش آنزیمی را در حالتی که سرعت واکنش نصف سرعت ماکزیمم شود را حساب کنید .

در غلظت های کمتر از سوبسترا سرعت واکنش متناسب با سوبسترا است اما در غلظت های بالا سرعت ثابت است

واحد آنزیم : مقداری از آنزیم که بتواند در مدت زمان یک دقیقه و شرایط اپتیمم یک میکرومولکول سوبسترا به محصول تبدیل بکند و به صورت IU/Lit نشان می دهند .

IU= International unit

ü هر چه چقدر K_m کمتر باشد آنزیم قوی تر است ، منحنی طبق فرمول میکائیلیس منتون یک منحنی سهمی است و بررسی سختر است .

دانشمندی به نام لینووربرگ با تقسیم 1به طرفین منحنی ، منحنی خطی را به دست آورد که در این منحنی تغییرات عکس سرعت ( 1/V) برای عکس غلظت سوبسترا منحنی خطی بود .

محل تماس منحنی با محور عرض ها را ( 1/v_max) و محل تماس با محور طول ها را ( -1/k_m ) می نویسیم .

{برگشت پذیر { رقابتی

مهار کننده ها : {غیر برگشت پذیر { غیررقابتی

برخی از مواد می توانند عملکرد آنزیم ها را در نتیجه ی اتصال به ساختمان یا جایگاه فعال و یا سوبسترا مهار کنند ، اگر این مهار کننده بعد از مدتی غیر فعال و آنزیم عملکرد خود را به دست بیاورد برگشت پذیر است ، در غیر اینصورت غیر برگشت پذیر است ، برگشت پذیر به دو نوع رقابتی و غیر رقابتی تقسیم می شود .

رقابتی : در این نوع ماده ی مهار کننده از لحاظ ساختاری شبیه سوبسترا است .

موارد زیر بایستی مد نظر باشد :

1. مهار کننده در این نوع به جایگاه فعال آنزیم متصل می شود

2. اختصاصی روی یک آنزیم عمل می کند .

3. اگر غلظت سوبسترای اصلی بیشتر شود مهار شدن آزاد می شود

4. بعنوان مثال اسید سوکسینیک دِهیدروژناز دارای دو جایگاه فعال است که عوامل کربوکسیل سوبسترا در این جایگاه قرار می گیرند ، سوبسترای اصلی اسید سوکسینیک است که در نتیجه ی عمل اسید مالونیک می تواند مهار شود .

در این واکنش ها یا در نوع رقابتی با افزایش غلظت سوبسترا سرعت واکنش بیشتر خواهد شد و به سرعت ماکزیمم خواهد رسید .

K_mدر این واکنش ها از لحاظ عددی کمتر خواهد شد .

مهار کننده های غیر رقابتی :

در این مهار کننده ها آنزیم در جایگاه فعال مهار نمی شود بلکه مهار کننده می تواند با تغییر در شکل آنزیم یا مواد شیمیایی یا پیوند های شیمیایی عملکرد آنزیم را مهار بکند .

ü در حضور مهار کننده های رقابتی سرعت واکنش در مقابل غلظت های بیشتر سوبسترا افزایش و به سرعت حداکثر می رسد ، مقدار K_m هم افزایش می یابد .

ü در غیر رقابتی ها مهمترین مواد ، موادی هستند که با گروه های SH یا سولفورید رقابت کرده و به جای اینها جایگزین می شوند از جمله مصمومیت با فلزات سنگین . در این مهار کننده ها K_m ثابت است ، اما سرعت تغییر پیدا خواهد کرد .

از مهار کننده های برگشت پذیر برای درمان نیز استفاده می کنیم به عنوان مثال باکتری ها از ویتامینی به نام اسید فولیک برای تقسیم استفاده می کنند ، دارو هایی به نام سولفانامید (سفالکسین ) در درمان استفاده می شود که مشابه اسید فولیک است .

غیر برگشت پذیر : آنزیم عملکرد خودش را به طور دائم از دست می دهد و هیچ وقت هم جایگزین نخواهد شد . مهمترین مثال آن مسمومیت با گاز های جنگی است .

واکنش های آلوستریک :

در این واکنش های چند آنزیمی که به صورت زنجیروار هستند محصول یک واکنش سوبسترا برای واکنش دیگر است مثلا ً تره اونین که یک اسید آمینه است در طی واکنش آنزیمی و با شروع آنزیمی به نام دِهیدراتاز در طی چند مرحله به ایزولوسین تبدیل می شود . اگر ایزولوسین غلظتش بیشتر باشد این سیر آنزیمی بلوک یا مهار می شود .

ایزو آنزیم :

یک آنزیم در جاهای مختلف و در اشکال مختلف که از لحاظ مولکولی تفاوت جزئی داشته باشند

پرو آنزیم :

اکثر آنزیم ها در بدن به صورت غیر فعال سنتز می شوند اما با از دست دادن قسمتی از ساختمان می توانند به شکل فعال درآیند که این فرم غیر فعال را پیش آنزیم می گویند مانند پپسینوژن

Log phase :

مرحله ای که سوبسترا با آنزیم پیوند برقرار کرده ولی واکنش آنزیمی شروع نشده است .

انواع آنزیم :

اکسیدو ردوکتاز : باعث اکسیداسیون یک جسم و احیاء جسم دیگر می شوند ، کوآنزیم ، آنزیم های اکسیداز ، هیدروکسیداز و دِهیدروژناز هستند .

ترنسفراز :

نقل و انتقال مواد را انجام می دهند ، مانند هگزوکیناز که گروه فسفر را انتقال می دهد

هیدرولاز :

باعث هیدرولیز پیوند های پپتیدی می شود .

لیاز :

با جدا کردن گروه هایی مثل C - H , C - S , C - C بند دوگانه ایجاد می کنند .

ایزومراز :

که یک ایزومر نوری را به ایزومر بعدی تبدیل می کند .

لیگاز :

باعث پیوند دو تا ماده به هم می شود

شرح کار

Ph مناسب و اپتیمم فزیولوزیکی7 خنثی کمی مایل به قلیایی در نظر میگیریم .

عوامل فزیکوشیمیایی موثر در فعالیت انزیم ها به سه دسته میتوان تقسیم کرد:

اثر مهار کننده ها بر فعالیت انزیم

اثر PH بر فعالیت انزیمی

اثر دما بر فعالیت انزیم

ازعوامل موثربر فعالیت آنزیم PH است که تاثیر بسزایی دارد درواقع می توانیم بگوییم هر آنزیمی PH بهینه دارد مطلوبترین PH نقطه ای است که آنزیم فعالترین و بهترین عملکرد را دارا باشد. مقدار بسیار بالا وبسیار پایین PH اثر کاهشی در فعالیت آنزیم دارد. درواقع PH یک عامل در پایداری آنزیم محسوب میشود

آنزیم های اکثرا پروتئینی هستند و با کاهش انرژی فعال سازی واکنش های شیمیایی باعث افزایش سرعت واکنش می شوند و در آخر هم بدون مصرف باقی می مانند آنزیم ها کاتالیزورهای سیستم های بیولوژیکی هستند و موجب تبدیل اشکال مختلف انرژی بهم دیگر می شوند.lاز مشخصّات قابل توّجه آنزیم ها قدرت کاتالیزوری بالا و اختصاصی بودن آنها بوده و بعلاوه فعّالیّت عدّه زیادی از آنزیم ها قابل تنظیم می باشد.تقریباً تمامی آنزیم های شناخته شده ، ساختمان پروتئینی دارند ولی کشف مولکولهای RNA فعّال از نظر کاتالیزوری نشان داد که فقط پروتئین ها نمی توانند کاتالیزورهای بیولوژیکی مطلق باشند

به استثنای ریبوزیم، همهٔ آنزیم های شناخته شده ، دارای ساختمان پروتئینی هستند. برخی آنزیم ها ، پروتئین های ساده بوده و مرکب از زنجیره های پلی پپتیدی هستند. مثالهایی از این نوع آنزیم ها ، آنزیم های هیدرولیتیک پپسین ، تریپسین و … هستند

ابتدا در 3 تا لوله ازمایش که در هر کدام 5 سی سی نشاسته 5 درصد 2 سی سی محلول امیلازو 1 قطره محلول یدو لوگولاظافه مکنیم بعد در لوله های 1 تا 3 به ترتیب 2 سی سی از بافر های با ph اسیدی و خنثی و قلیا یی ریخته و سرو ته کرده و به مدت 7 دقیقه در بن ماری دمای 37 درجه قرار می دهیم.دقت شود که معرف یدولوگل در اخر اضافه شود وبا توجه به تغییرات رنگ نتایج را بررسی می کنیم یعنی رنگ ابی مایل به بنفش.ولوله ای که کمترین تغییر رنگ را داشته باشد ph نزدیک به اوپتیمم را داردو انزیم امیلاز بیشترین فعالیت را در این محیط داشته است و تمام نشاسته را هیدرولیز کرده

تئوری آزمایش

ابتدا در 3 تا لوله ازمایش که در هر کدام 5 سی سی نشاسته 5 درصد 2 سی سی محلول امیلازو 1 قطره محلول یدو لوگل اضافه می کنیم بعد در لوله های 1 تا 3 به ترتیب 2 سی سی از بافر های با ph اسیدی و خنثی و قلیا یی ریخته و سرو ته کرده و به مدت 7 دقیقه در بن ماری دمای 37 درجه قرار می دهیم.دقت شود که معرف یدولوگل در اخر اضافه شود وبا توجه به تغییرات رنگ نتایج را بررسی می کنیم یعنی رنگ ابی مایل به بنفش.ولوله ای که کمترین تغییر رنگ را داشته باشد ph نزدیک به اوپتیمم را داردو انزیم امیلاز بیشترین فعالیت را در این محیط داشته است و تمام نشاسته را هیدرولیز کرده

نتیجه

امیلاز در محیط قلیایی تا حدودی عمل کرده و رنگ ابی بنفش جزیی ایجاد کرده و تا حدودی فعالیت داشته اما در محیط اسیدی انزیم عمل نکرده و رنگ تیره ای را درست کرد اما در محیط حنثی در حداکثر توان خود عمل کرده و محیط کاملا برنگ شده بود.

نظرات شما عزیزان: